苯甲醇是一种重要的中间体，能用于化学、制药和聚合物工业中许多不同化合物的商业制备。目前苯甲醇的工业生产主要利用甲苯作为原料，通过化学法生成，该过程繁琐且会生成大量副产物而污染环境。因此，如何发展苯甲醇的绿色高效生产方法一直受到工业界和学术界共同关注。
近日，湖北大学生命科学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室李爱涛教授、陈纯琪教授和郭瑞庭教授团队共同合作，成功解决了这一难题。他们首次解析了一种特殊的“万能酶”P450tol及其复合体晶体结构，并基于此构建了一种活性和稳定性均明显提升的人工融合酶，实现了苯甲醇的高效绿色生物合成，相关研究成果发表于国际期刊《催化作用》。
迄今唯一可天然催化甲苯生成苯甲醇的酶
酶，这种地球生命中最强大的化学工具，通过理性设计和定向进化手段，展现出了在生物催化领域的强大功能。其中，细胞色素P450酶能够识别多种底物(参与生化反应的物质)，因此也被称为“万能酶”。而利用基因工程改造P450酶来量身定制化学反应过程和生产工艺，成为一个热门研究方向。
李爱涛从甲苯降解菌中鉴定了一种特殊的P450酶，并将其命名为P450tol。它能以甲苯为底物，生成专一的产物苯甲醇，成为迄今发现的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。
目前苯甲醇通用的工业生产采取两步法，以甲苯为原料，需要用到剧毒的氯气和强碱氢氧化钠，并产生有毒副产物。“之所以会这样，是因为传统化学合成过程中，绕不开C-H键官能团化。”李爱涛解释，由于C-H键具有较高的解离能，通常具有较高的热力学稳定性和较低的化学反应性，因此，C-H键官能团化是传统化学合成中一个极大的难题。
因此，李爱涛发现的P450tol让人们看到了生物合成苯甲醇的希望。然而P450tol三维结构信息的缺乏，限制了P450tol的相关基础研究与未来应用。
配体结合方式使反应更精准高效
要改造高效的P450tol，必须揭开酶结构的面纱。由于2020年郭瑞庭团队首次解析了一种自给自足P450酶的全长晶体结构，李爱涛选择与郭瑞庭团队合作，顺利解析出P450tol的空结构以及与底物甲苯及产物苯甲醇的复合体结构。这些结构信息表明，P450tol能帮助甲苯通过一步反应生成苯甲醇，且反应没有副产物。
陈纯琪介绍，P450酶的活性区都会带一个血红素分子参与催化反应，我们解析的P450tol也不例外，底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸组成的口袋中，甲苯的甲基朝向血红素中心的铁离子，两个氨基酸(F329和A279)分别位于底物的两侧，牢牢钳住了甲苯的苯环，甲苯前方还有一个氨基酸(V326)负责固定整个甲苯的位置，这样催化反应就可以精确的发生在苄基位，而不是其他位置，如此精巧地反应也只有这种“万能酶”可以做到了。
“此外，我们也观察到了一个非常有意思的现象，甲苯或苯甲醇并不能将P450tol的活性区完全占据，还有一些多余的空间，所以我们猜测P450tol或许可以结合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。”陈纯琪表示，复合体结果与团队推测的一致，P450tol也可以与一些卤代甲苯形成复合体，且可以精确地在苄基位发生羟基化反应。所有这些结果都显示，配体会以有利于反应发生的方式结合并参与反应，这也使酶的反应更精准而高效。
人工融合酶有望用于工业生产
自然界中大部分的P450酶都需要一个能够与之匹配的还原酶来提供电子以发生催化反应，这对于后续的应用也是一个难题。为了实现工业应用，寻找天然的自给自足型P450酶或者索性构建高效的自给自足型P450人工融合酶成为科研工作者关注的焦点。
“我们将P450tol和CYP116B46的还原酶结构域融合，构建出自给自足型人工融合酶，其活性、稳定性和半衰期都获得了很大的提升。”李爱涛说。
不仅如此，P450tol-CYP116B46还可以催化丙基苯在近末端或苄基位区域选择和立体选择羟基化，这些羟基化产物中，有些是非常重要的药物中间体，如安非他命、司立吉林和组蛋白酶K抑制剂的组成成分。目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例报道的稳定性和活性均大幅提升的人工融合酶，未来有望应用于工业生产中。
基于P450tol的三维结构，郭瑞庭团队使用蛋白质工程的手段理性设计和改造，使其反应能够更多地朝向对人类有益的方向发生。
“未来，随着结构生物学、人工智能、酶定向进化等发展，通过理性设计和改造，获得更多新的具有重要功能的酶来造福于人类，将会是一个重要的研发方向，我们也将继续致力于更多P450tol人工融合酶的构建。”郭瑞庭说。(陈曦)
